Memo (1)

Novel ATP sensing methods:
Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 8298
廣告

DSC, Differential Scanning Calorimetry

    DSC(熱示差掃瞄卡量計),Differential Scanning Calorimetry,利用的原理是將樣品與參考物放在可以做等速升降溫或是核定溫度的chamber內,並通以穩定流速的氣體(如:氮氣),使得chamber內氣體環境保持恆定,了解樣品在固定溫度下加熱或是冷卻的時候,或是保持恆溫狀態時,熱焓量的變化,並連續地以能量差的方式記錄下來。

    Sample發生溶融、蒸發、結晶或是相變化等物理化是化學反應時,皆會伴隨吸熱或是放熱反應,這使樣品跟參考物之間產生溫度差或是熱阻抗的差值,在DSC圖譜上便會出現吸熱或釋放熱的peak,進而可以推測樣品的性質。

    目前DSC的設計一般都採熱流式設計(Heat Flux DSC),主要是將樣品與參考物至於內含兩個sample holder的chamber內,由於是單一的加熱爐體,因此共用一條加熱絲,在兩個sample holder中各有一個獨立的sensor,分別量測sample跟參考物之間的溫度,當樣品在定溫下加熱、冷卻或恆溫方式進行實驗,樣品會因為吸熱或放熱,使得其與參考物之間產生溫度差ΔT,DSC以連續的方式記錄溫度差,再利用ΔQ=ΔT‧R這個關係式去了解能量的變化,顧這種測熱的方法屬於間接式的焓量變化。

 Image

圖一:熱流式DSC 剖面圖。單一爐體由一個加熱絲提供能量,兩個樣品容納器下各有一獨立的感溫器(Thermocouple),樣品與參考物空盤分別置於左右兩側的樣品容納器上,由樣品容納器下方的感溫器可量測兩者間的溫度差。

    溫度差ΔT=Ts(樣品溫度)-Tr(參考物溫度),由於能量變化是由ΔT轉換為ΔQ,在一定的時間下,ΔT的大小與熱焓量的變化、樣品比熱、總熱阻抗值(R)成比例,其中影響DSC靈敏度最大的因素是R值。R值越高,DSC的靈敏度越高,而影響R值的變數則包含樣品性質、樣品形狀、樣品阻抗值、接觸面積、爐體新舊、氣氛變化及溫度等有關,其中樣品阻抗值則以預測值計算,因此根據一般發表之論文可知熱流式DSC 所量測的能量誤差約為5 ﹪。

    熱流式DSC 在設計上將樣品和參考物置於同一個加熱爐中,為了避免彼此相互干擾,,兩者間必須有一定的距離,故熱流式DSC 的爐體通常較大(直徑約5 公分)。同時,也因為爐體較大,直接影響到DSC 的升降溫速度,目前市面上熱流式DSC 最快的升溫速度為每分鐘200℃。在爐體材質上,一般多採用Cu-Cr 合金、Cu-Ni 合金或Ag,雖然這些材質具有耐高溫的優點,卻不耐氧化,且抗酸鹼及耐腐蝕的能力卻不佳。

    在藥物分析上面DSC主要是可以了解藥物的熱穩定性、氧化穩定性跟玻璃態轉變測定;在胺基酸及蛋白質的測定上則可以了解其催化的機轉;在生物材料上面則是進行純度的測定。熱分析具有用量少、靈敏度高、快速的特點,因此十分適合藥廠評估藥物的純度,若藥物中有微量雜質存在,熔點變會下降,熔化的過程也會加長;許多的藥物在加工過程中會產生兩種以上的晶型,熱力學上穩定性較差的晶型會具有較低的熔點,因此具有多晶型的藥物在熔解過程中可能具有多個熔點,熔化後可能會再結晶,藥物多晶型的現象對於藥理性質及生物可用率等都有明顯的影響,因此可以透過控制晶型及其比例改變藥物的釋放過程,進而改變藥物的生物活性。

 

    許多藥品再生產的過程中需要將活性物質的水容易在不破壞組成及結構的前提下進行冷凍乾燥法,冷凍乾燥法包含兩個步驟:冷凍水溶液及抽真空使吸附的水蒸發,以節省能源的角度,要能知道藥品在不破壞結構與組成之下能接受的最低冷凍溫度。在冷凍藥品容易的過程中,溶質相可能形成無定型的濃縮相,且具有特徵的玻璃轉換溫度(Tg),也可能形成共晶體,加熱晶化的藥品可能造成藥品的熔化或回熔。在製藥工業上凍乾溫度應該低於Tg,以免在凍乾過程中破壞藥品結構;另外,DSC也可以研究蛋白質在升溫時結構產生的微量破壞及其熱穩定性。

 

 

參考資料:

差示扫描量热仪(DSC)在药物分析中的应用 www.perkinelmer.com.cn

熱示差掃瞄卡量計 DSC的原理                     博精儀器

第七章:熱分析                   劉銘璋 林岱瑋 王漢松 張秋玲  台灣大學化學系

ESI, Electrospray Ionization

l   電噴灑法(ESI)基本原理:

    電噴灑法(ESI, Electrospray Ionization)可以將溶液中分子利用高電壓差離子化為氣相離子,並利用質量分析器分析荷質比 (m/z)了解分析物的分子量,藉由ESI技術,研究者可以進行高分子量的生物巨分子研究,也因為擺脫傳統離子化方法分子量及分析物化學性質的限制,ESI的提出者Dr. John B. Fenn在2002得到諾貝爾獎。

    ESI的構造非常簡單,由金屬製的毛細管針尖及相對電極構成,在針尖與相對電極之間加以高電壓差,並在毛細管內通入分析物溶液,再藉由霧化氣體(Nebulization gas)的幫助使水溶液帶電並形成微液滴。在毛細管針尖,微液滴會形成泰勒錐,並在飛行至質量分析器的過程中desolvation分裂成更微小的液滴,有兩種方式試圖解釋不斷分裂的帶電液滴最後是如何形成不含溶劑分子的氣相離子:離子蒸發模式(Ion Evaporation Model)中,液滴中離子可以在強電場中直接脫離溶劑形成氣相分子,此模式適合解釋小氣態離子的產生;電荷殘餘模式(Charge Residue Model)中,每個液滴在經過多次分裂後體積縮小且含有單一分析物離子,溶劑會在飛行過程中因氣體碰撞得到能量而脫離分析物,此模式適合解釋大氣態分子的產生。在增加ESI的效率上,利用Polar Organic Solvent增加溶劑的揮發速度及減少表面張力;利用Nebulization Gas或是Curtain gas/Turbo gas使溶劑受熱加速揮發都是常見的方法。

    若分析物以蛋白質為例,蛋白質的鹼性胺基酸及胺端在酸化的過程中會與H+結合帶正電,經ESI後即形成帶有不定數量正電荷的離子,並利用以下聯立方程式計算出分析物的分子量M:

M1=(M+n1)/n1 ; M2=(M+n2)/n2  

另外利用同位素訊號峰也可以解析出小蛋白質的分子量,但由於一般質譜儀的解析度並不高,無法相同位素訊號分開,因此在大多數情形中仍然使用上列聯立方程式計算。

l   ESI的應用與發展

    ESI為一種離子源,分析物產生離子後仍然需要利用離子分析器了解m/z,最常見的質量分析器是使用四極棒質量分析器(Quadrupole)─由四個平行電極棒組成,上面加以DC及高頻率交流電,藉由調整AC的參數讓不同m/z的離子通過四極棒達到質量分析器的功能,而ESI使蛋白質離子帶上多電荷克服了四極棒的質量限制(m/z上限=3000-4000);離子阱質量分析器(Ion Trap)則具有較高的靈敏度,並提供Protein ID的鑑定,而結合四極棒及離子阱並具有定性及定量功能的Q-Trap也是接在ESI後常見的質量分析器。

    四極棒及離子阱的Resolution皆為單位解析度,改經由直交式飛行時間質量分析器(Orthogonal Time-of-flight)後解析度提升到10000,在這個解析度下便能進行Protein ID及分離同位素訊號峰;近年來在蛋白質體學中,利用傅立葉轉換離子迴旋共振質量分析器(FT-ICR)可達到上百萬的解析度,但由於技術及價格原因未得到普遍的使用。

    ESI及MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)兩種離子化方法使蛋白質的分子量可以被精確測定,因此有學者提出Protein ID的概念,每個蛋白的質譜pattern皆與其序列有關,利用特定的蛋白酶水解後得到帶白質片段的質量分布,並配合資料庫的比對便能鑑定出蛋白質的身分。Protein ID資料庫對於瞭解人類蛋白質體有巨大的影響,並且相對於傳統Edman蛋白質定序儀較省時且樣本量較少。

    研究中發現ESI產生的質譜訊號與較無關,與sample濃度較有關,因此利用fused silica capillary及微機電系統(MEMS)技術可以使樣品量減少,並提供穩定的離子源,這樣更精密的技術稱為Microspray或Nanospray,對於許多細胞傳訊分子或是微量表現的蛋白質,Nanospray都可以提供靈敏的分析。

    隨著研究技術的進步,不論是離子化方法、質量分析器,質譜儀在發明後100年內有長足的進步,ESI對於液態sample的處理相對於MALDI適合,並利用毛細管技術及超高解析度的質量分析器,質譜儀已經是蛋白質體學最常見的儀器之一了,相信在未來的十年內,隨著質譜儀的在進化,蛋白質體學及代謝體學等系統生物學領域的研究將會有巨大的發展。

Quadrupole mass analyzer : an overview

    Quadrupole mass analyzer就如其名一樣,是由四根平行的棒狀構造所組成,在一台具有四極棒的質譜儀中(Quadrupole Mass Sepctrometer,QMS),四極棒可以利用震盪附加在四極棒上面的電場並根據樣品的m/z關係分離樣品,

    四極棒(Quadrupole)是由四根金屬棒組成,每一組兩兩相對於X軸及Y軸的電極會通入相位一樣的正、負交流電,並同時通入交流電壓(無線電頻率),在固定的直流電及交流電壓下,兩者互相疊加,只有一定範圍荷質比(m/z)的離子才可以通過到達偵測器,其餘離子便會撞至電極棒上,最後被真空系統吸走;利用調整直流電及交流電壓,便可以控制通過離子的荷質比,因而得到一個分子完整的質譜圖。四極棒質量分析器廣泛的應用在GC/MS,LC/MS中,對於蛋白質等生物巨分子來說,四極棒質量分析器有以下優點:QMS利用直流電疊加交流電進行掃描,因此可以在比較高的壓力下(~5×10-5 torr)進行質量分析,並可以結合連續進樣法及電噴灑法(ESI)來進行樣品分析;另外,QMS的掃瞄範圍可以達m/z=6000,大部分的生物巨分子經由電噴灑法游離過後,帶有多重電荷,m/z大概在400-6000之間,相當有利於質量的分析。

    理論上的四極棒設計中,電擊棒的切面應該為拋物線型(橢圓形),但因圓柱形的電極棒較容易製造(需特定的圓柱直徑-游離空間比值),若在設計上面圓柱直徑-游離空間比值有誤差的話將嚴重影響到質量分析器的解析力及質譜圖的形狀,各家廠商對於四極棒的設計有些許的不同,目前也有廠商將電極棒形狀設計為橢圓形柱。

    近年來Triple quadrupole mass spectrometer(QqQ)廣泛的被應用在生在分析上面,基本上QqQ是三組四極棒以線性排列,Q1與Q3作為質量分析器,過濾特定m/z的離子,Q2則做為碎裂Q1分析過離子的腔室,在Q2中只有施加交流電(RF-only),並利用Ar,He,N等氣體作為collision induced dissociation gas,QqQ可以作為解構鑑定的工作之一,Q1可以將有興趣的分子分析出來;經過Q2的碎裂後,再利用Q3分析Daughter ion。

 

Reference: 第三章 質譜技術與蛋白質體學,蛋白質體學 陳玉如

組織照張相-XI

H3.25 Muscle 3 type : Smooth muscle , Skeletal muscle , Cardiac muscle

H5.33 Esophagus c.s cardiac area : smooth muscle

HM3513 Muscle 3 type : Smooth muscle , Skeletal muscle , Cardiac muscle

MH0922 small intestines : smooth muscle

H8.12 Heart Purkenje fibers

H7.13 Muscle and tendon l.s

H01/24 Ventricular wall sec.

H01/22 Cardiac muscle l.s , Intercalated discs

5.31 Esophagus c.s upper region

5.32 Esophagus c.s : mix ( smooth and skeletal muscle )

 

組織照張相-X

H2.41 Embryonic Connective Tissue , Osteocytes , Osteoblast , Osteoclast (Ruffled Border) , Osteoprogenitor Cell , Intramembranous Ossificaiotn

H2.78 Bone Developing , Bone lining cell , Osteoblast , Osteoclast

H2.76 Bone Callus (Endochondral Ossification)

H2.77 Bone Developing Section (Endochondral Ossification)

93W6138 Human compact bone Ground Preparation , Osteocyte ,  Outer circumferential Lamellae , Harversian System

H01/12 Human compact bone Decalcification , Osteocyte ,  Outer circumferential Lamellae , Canaliculi ,  Volkmann Canal